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Jul 17, 2023

Los nuevos métodos de microscopía de expansión magnifican el impacto de la investigación

Ahora es posible obtener vistas sin precedentes del interior de las células y otras estructuras a nanoescala gracias a las innovaciones en microscopía de expansión. Los avances podrían ayudar a proporcionar información futura sobre

Ahora es posible obtener vistas sin precedentes del interior de las células y otras estructuras a nanoescala gracias a las innovaciones en microscopía de expansión. Los avances podrían ayudar a proporcionar conocimientos futuros sobre la neurociencia, la patología y muchos otros campos biológicos y médicos.

En el papel"Magnify es una estrategia de anclaje molecular universal para microscopía de expansión", publicado en la revista Nature Biotechnology, colaboradores de la Universidad Carnegie Mellon, la Universidad de Pittsburgh y la Universidad de Brown describen nuevos protocolos para el denominado Magnify.

"Magnify puede ser una herramienta potente y accesible para la comunidad biotecnológica", afirmó Yongxin (Leon) Zhao, profesor asociado de ciencias biológicas de desarrollo profesional de la familia Eberly.

El Laboratorio de Biofotónica de Zhao es líder en el campo de permitir imágenes de súper resolución de muestras biológicas a través de muestras en expansión física en un proceso conocido como microscopía de expansión. A través del proceso, las muestras se incrustan en un hidrogel hinchable que se expande de manera homogénea para aumentar la distancia entre las moléculas, lo que permite observarlas con mayor resolución. Esto permite ver estructuras biológicas a nanoescala que antes solo podían verse utilizando costosas técnicas de imágenes de alta resolución con herramientas de microscopía estándar.

Magnify es una variante de la microscopía de expansión que permite a los investigadores utilizar una nueva fórmula de hidrogel, inventada por el equipo de Zhao, que retiene un espectro de biomoléculas, ofrece una aplicación más amplia a una variedad de tejidos y aumenta la tasa de expansión hasta 11 veces de forma lineal o ~1.300 pliegues del volumen original.

"Superamos algunos de los desafíos de larga data de la microscopía de expansión", dijo Zhao. "Uno de los principales puntos de venta de Magnify es la estrategia universal para mantener las biomoléculas del tejido, incluidas las proteínas, los ácidos nucleicos y los carbohidratos, dentro de la muestra ampliada".

Zhao dijo que mantener intactos los diferentes componentes biológicos es importante porque los protocolos anteriores requerían eliminar muchas biomoléculas diferentes que mantenían unidos los tejidos. Pero estas moléculas podrían contener información valiosa para los investigadores.

"En el pasado, para hacer que las células fueran realmente expandibles, era necesario utilizar enzimas para digerir las proteínas, por lo que al final teníamos un gel vacío con etiquetas que indicaban la ubicación de la proteína de interés", dijo. Con el nuevo método, las moléculas se mantienen intactas y se pueden marcar múltiples tipos de biomoléculas en una sola muestra.

"Antes, era como tener preguntas de opción única. Si quieres etiquetar proteínas, ese sería el protocolo de la versión uno. Si quieres etiquetar núcleos, entonces sería una versión diferente", dijo Zhao. "Si querías obtener imágenes simultáneas, era difícil. Ahora, con Magnify, puedes elegir varios elementos para etiquetar, como proteínas, lípidos y carbohidratos, y visualizarlos juntos".

Los investigadores de laboratorio Aleksandra Klimas, investigadora postdoctoral y Brendan Gallagher, estudiante de doctorado, fueron los primeros coautores del artículo.

"Esta es una forma accesible de obtener imágenes de especímenes en alta resolución", dijo Klimas. "Tradicionalmente, se necesitan equipos costosos, reactivos específicos y capacitación. Sin embargo, este método es ampliamente aplicable a muchos tipos de preparaciones de muestras y se puede observar con microscopios estándar que se tendrían en un laboratorio de biología".

Gallagher, que tiene experiencia en neurociencia, dijo que su objetivo era hacer que los protocolos fueran lo más compatibles posible para los investigadores que podrían beneficiarse de la adopción de Magnify como parte de sus kits de herramientas.

"Uno de los conceptos clave que intentamos tener en cuenta fue reunirnos con los investigadores donde están y hacer que cambien la menor cantidad posible de cosas en sus protocolos", dijo Gallagher. "Funciona con diferentes tipos de tejido, métodos de fijación e incluso tejido que se ha conservado y almacenado. Es muy flexible, en el sentido de que no es necesario rediseñar completamente los experimentos con Magnify en mente; funcionará con lo que ya se tiene. ".

Para investigadores como Simon Watkins, fundador y director del Centro de Imágenes Biológicas de la Universidad de Pittsburgh y del Instituto del Cáncer de Pittsburgh, el hecho de que el nuevo protocolo sea compatible con una amplia gama de tipos de tejidos, incluidas secciones de tejido preservadas, es un factor decisivo. importante. Por ejemplo, la mayoría de los métodos de microscopía de expansión están optimizados para tejido cerebral. Por el contrario, Magnify se probó en muestras de varios órganos humanos y tumores correspondientes, incluidos los de mama, cerebro y colon.

"Digamos que tienes un tejido con componentes densos y no densos, esto evita tejidos que antes no se expandían isométricamente", dijo Watkins. "Leon ha estado trabajando duro en esto para que este protocolo funcione con tejidos que han sido archivados .”

Xi (Charlie) Ren, profesor asistente de ingeniería biomédica en Carnegie Mellon, estudia el tejido pulmonar y cómo modelar su morfogénesis y patogénesis. Parte de su investigación implica investigar los cilios móviles que funcionan para eliminar la mucosidad en las vías respiratorias humanas. Con 200 nanómetros de diámetro y sólo unos pocos micrómetros de longitud, las estructuras son demasiado pequeñas para verlas sin una tecnología que requiere mucho tiempo, como la microscopía electrónica. Trabajando en colaboración con el laboratorio de Zhao, el equipo de Ren desarrolló y entregó modelos organoides pulmonares con defectos específicos en la ultraestructura y función de los cilios para validar la capacidad de Magnify para visualizar patologías de los cilios clínicamente relevantes.

"Con las últimas técnicas de Magnify, podemos expandir esos tejidos pulmonares y comenzar a ver alguna ultraestructura de los cilios móviles incluso con un microscopio normal, y esto acelerará las investigaciones tanto básicas como clínicas", dijo.

Los investigadores también pudieron observar defectos en los cilios en células pulmonares específicas de cada paciente que se sabe que tienen mutaciones genéticas.

"La comunidad de ingeniería de tejido pulmonar siempre necesita una mejor manera de caracterizar el sistema de tejido con el que trabajamos", dijo Ren. Añadió que este trabajo es un primer paso importante y espera que el trabajo colaborativo con el laboratorio de Zhao se refine y aplique aún más. a muestras de patología encontradas en bancos de tejidos.

Finalmente, el hidrogel utilizado en Magnify y desarrollado en el laboratorio de Zhao es más robusto que su predecesor, que era muy frágil, provocando roturas durante el proceso.

"Esperamos desarrollar esta tecnología para hacerla más accesible a la comunidad", dijo. “Hay diferentes direcciones que esto puede tomar. Hay mucho interés en utilizar este tipo de tecnología de expansión de tejido para la ciencia básica”.

Alison Barth, profesora Maxwell H. y Gloria C. Connan de ciencias biológicas en Carnegie Mellon, estudia la conectividad sináptica durante el aprendizaje. Dijo que las amplias aplicaciones que ofrecen los nuevos métodos serán una gran ayuda para los investigadores.

"El cerebro es un gran lugar para aprovechar estas técnicas de superresolución", afirmó Barth, que colabora con el Laboratorio Zhao en varios estudios. “Los métodos de microscopía serán beneficiosos para el fenotipado y el análisis sináptico en diferentes condiciones cerebrales. Uno de los principales avances de este artículo es la capacidad del método para funcionar con muchos tipos diferentes de muestras de tejido”.

Otros autores del estudio incluyen a Piyumi Wijesekara, Emma F. DiBernardo, Zhangyu Cheng de Carnegie Mellon; Sinda Fekir y Christopher I. Moore de la Universidad de Brown; Donna B. Stolz de Pitt; Franca Cambi de Pitt y la Administración de Veteranos; y Steven L Brody y Amjad Horani de la Universidad de Washington.

Este trabajo fue apoyado por Carnegie Mellon, la Fundación Kaufman y la Fundación Benéfica DSF, el Departamento de Defensa de EE. UU. (VR190139), los Institutos Nacionales de Salud (DP2 OD025926-01 y NIH RF1 MH114103), la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (FA9550 -19-1-13022629), NeuroNex (GR5260228.1001) y Universidad de Brown.

- Este comunicado de prensa fue proporcionado por la Universidad Carnegie Mellon.